当前位置: 主页 > 企业战略 >

PCR技术的完善和基因克隆技术的逐渐成熟

时间:2017-06-27 09:47来源:未知 作者:admin 点击:
    这两起基因治疗的尝试,让人们意识到基因治疗不仅门槛很高而且面临着更为复杂的伦理问题,这样没有监管的盲目尝试是极其危险的。不久美国NIH DNA 重组委员会组建了基因治疗分委员会,经过讨论人们逐渐意识到摆在面前的几个障碍:首先是如何实现高效的DNA整合,如何准确的获得特定的功能基因;其次如何在靶细胞中高效的传递目的基因。在这些困难没有解决之前,基因治疗不可能成功。这标志着基因治疗已经开始逐渐走向正轨,逐渐开始规范化和系统化。
 
    1984年西斯特公司的穆利斯(K.B.Mullis)开发的聚合酶链式反应(PCR)技术首次获得成功,他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR技术的完善和基因克隆技术的逐渐成熟,使人们能够准确的获取目的基因。1970年巴尔的摩(Baltimore)发现的逆转录病毒,不仅完善了中心法则,更是为基因治疗提供了高效的导入方法。此外,腺病毒、腺相关病毒(AAV)和慢病毒等病毒系统也逐渐被开发利用[3]。
 
    至此,基因治疗的主要障碍逐渐被攻克,多个研究组的体内外动物实验也验证了病毒介导的基因纠正和替代的可行性和有效性。人们再一次相信基因治疗近在咫尺了,众多的临床试验如雨后春笋般一个个开展起来。
 
    在黑暗中摸索的人们开始了大胆的尝试:经过多年的研究,1968年Rogers和Pfuderer第一次在烟草花叶病毒中实验证实了病毒可以作为一种载体实现基因传递的作用。随后,他们在人体上第一次开展了基因治疗的尝试,运用野生型的肖普氏乳头状瘤病毒过表达精氨酸酶来治疗患精氨酸血症的一对姐妹。可惜的是,这次试验失败了,没有检测到精氨酸酶水平的升高,后来证实这种病毒体系无法表达精氨酸酶[1],幸运的这次试验没有对患者造成伤害,但是在那个无论对疾病还是基因递送和表达体系都不清楚的年代,这项试验显然是非常大胆的。
 
    1980年前后,美国加州大学洛杉矶分校(UCLA)的马丁·克莱因(Martin Cline)在再一次对基因治疗发起了挑战,这次他们选择的是地中海贫血症。他们利用DNA重组技术将β-球蛋白导入患者的骨髓细胞中,然后回输到体内。本次尝试因为效率非常低下而再次失败了,同时本次实验也受到了更广泛的质疑。调查发现克莱因并没有获得UCLA伦理委员会的批准,而且前期的动物实验并没有效果就直接应用到人体中[2]。克莱因本人也因为违反美国联邦法规而受到了严厉的制裁,同时被剥夺了系主任的职务。
 
    1990年美国NIH的威廉·弗伦奇·安德森(William French Anderson)开展了世界上首例正式批准的人体临床试验[4],利用逆转录病毒编码腺苷酸脱氨酶(ADA)来治疗重症联合免疫缺陷病(SCID)。
 
    首先从四岁女孩阿莎提·德席尔瓦(Ashanti DeSilva)提取白细胞,然后将编码正确ADA基因的逆转录病毒插入到白细胞基因组中,然后将细胞回输到体内。后续检测发现,女孩体内能正确合成腺苷酸脱氨酶,但是由于白细胞存活时间短,需要经常接受类似的治疗。尽管该疗法是否真正意义上获得成功还有争议,但是该临床试验都是基因治疗历史上重要的里程碑。